Kit de ensayo cuantitativo de proteínas de Coomassie (Bradford)

Dos de los métodos más utilizados para cuantificar la concentración de proteínas son el método de Bradford y el método BCA. El principio del método Bradford se basa en la rápida unión del azul brillante de Coomassie G250 a las proteínas. La absorción máxima de Coomassie Brilliant Blue G25{{10}} es de 488 nm en estado libre. Después de unirse a la proteína, la absorción máxima cambió a 595 nm. y el valor de absorción de luz es proporcional al contenido de proteínas, por lo que puede usarse para la detección cuantitativa de proteínas. Este método determina las concentraciones de proteínas independientemente de las sustancias químicas en la gran mayoría de las muestras, que pueden llegar a 1 mM para -mercaptoetanol y 5 mM para ditiotreitol; Sin embargo, afectado por concentraciones ligeramente superiores de agentes desincrustantes, es necesario asegurarse de que el contenido de SDS sea inferior al 0,01%, el contenido de Triton X-100 sea inferior al 0,05% y el Tween-20, El contenido de interpolación-60, interpolación-80, etc. es inferior al 0,015 %. El kit de detección cuantitativa de proteínas BCA (G2026) fabricado por nuestra empresa se recomienda para muestras que contengan agentes desincrustantes.

Este kit es fácil y rápido de operar, con alta sensibilidad y velocidad de detección extremadamente rápida, y puede detectar concentraciones de proteínas que van desde 25-1000 ug/mL.

Producto enviado a temperatura ambiente. Ampollas estándar de albúmina sérica bovina (BSA) almacenadas a 4 grados, válidas por 12 meses. La solución estándar de proteína, preparada con ampollas estándar de BSA y dilución de ampollas estándar, se almacena a -20 grado y se usa dentro de los 6 meses.

1. Preparación de la solución madre estándar de proteínas:Diluya 25 mg de ampollas estándar de albúmina sérica bovina (BSA) en 1 ml de dilución de ampollas estándar; La concentración de la solución madre estándar de proteínas es de 25 mg/ml y debe almacenarse a -20 grados.

2. Preparación de la solución de trabajo estándar de proteínas:Se diluye una cantidad adecuada de 25 mg/ml de solución madre estándar de proteínas 50 veces con PBS o solución salina normal para obtener una solución de trabajo estándar de proteínas con una concentración final de 0,5 mg/ml. Tenga cuidado de diluir según el método de gradiente de 10-veces para garantizar una dilución precisa.

3. Preparación de la curva estándar (método lector de microplacas):La solución de trabajo estándar de proteína se agrega a la placa de pocillos {{0}} a 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μL y luego PBS o Se agrega solución salina normal a la misma placa 96-pocillos a 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4, 0 μL para completar el gradiente anterior. solución de trabajo a 20 μL. Las concentraciones de proteína de las curvas de gradiente son 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 ug/ml.

4. Preparación de la muestra:Diluya adecuadamente la muestra que se va a analizar (mediante la detección preexperimental, la concentración de proteína de la muestra puede estar dentro del rango de la curva estándar para garantizar la confiabilidad del resultado de la prueba). Agregue 20 μL de muestras a una 96-placa de pocillos. La muestra a analizar y el estándar de proteína se diluyen con la misma solución.

5. Protocolo del tubo de ensayo:

a) Agregue 200 μL del colorante Coomassie G-250 a cada tubo y mezcle bien (la placa de pocillos 96- se puede agitar en un vórtex durante 30 s).

b) Incubar las muestras durante 3-5 minutos a temperatura ambiente (RT).

c) Se utilizó como referencia la curva estándar No. 0 y se midió colorimétricamente a 595 nm, y se registró el valor de absorbancia de cada pocillo.

d) Cálculo: Tome el contenido de proteína del gradiente (ug/mL) en la curva estándar como coordenada horizontal y el valor de absorbancia como coordenada vertical, y trace la curva estándar. De acuerdo con el valor de absorbancia de la muestra medida, la concentración de proteína (ug/mL) de la muestra a analizar en los pocillos correspondientes se puede encontrar en la curva estándar y luego multiplicarse por la dilución de la muestra que es la proteína real. concentración de la muestra a analizar.

e) Además: si se mide con espectrofotómetro, cambie el volumen de reacción estándar del gradiente a 1 ml en el paso 3. Agregue 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1,0 ml de solución de trabajo estándar de proteína (concentración de {{ 21}}.5 mg/mL) a 7 tubos de ensayo de vidrio limpios o tubos colorimétricos, luego agregue 1.0, 0.95, 0.9, 0.8, {{3{{32} }}}.6, 0.4, 0.2, 0 ml de PBS o solución salina a cada tubo en orden y luego complete la solución de trabajo del gradiente a 1 ml. La solución de trabajo del gradiente se repuso hasta 1 ml y cada tubo se mezcló minuciosamente para obtener la curva de gradiente con concentraciones de proteína de 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/ml.

f) Las muestras de proteína a analizar se diluyeron adecuadamente y se agregaron a tubos de ensayo de vidrio nuevos o tubos colorimétricos con un volumen de muestra de 1 mL.

g) Agregue 3 ml de colorante Coomassie G-250 a cada uno de los tubos de gradiente de curva estándar y tubos de muestra anteriores, mezcle bien y déjelo reposar durante 3-5 min a temperatura ambiente para la detección colorimétrica mediante espectrofotómetro.

h) La longitud de onda del fotómetro se fijó en 595 nm durante la detección, y la curva estándar y la muestra a analizar se detectaron con el tubo de curva estándar No. 0 como referencia para el ajuste a cero. Trazar la curva estándar y calcular la concentración de proteína en la muestra que se va a analizar según el método del paso 6.

1. El tinte Coomassie G-250 debe llevarse a temperatura ambiente y mezclarse boca abajo antes de usarlo para evitar afectar la sensibilidad del ensayo.

2. Al preparar la solución madre estándar de proteínas, asegúrese de que esté bien disuelta. Se recomienda diluir la solución de trabajo estándar de proteínas en un gradiente de 10-veces; no diluya 50 veces a la vez para evitar grandes errores.

3. Utilice gafas de seguridad, guantes o ropa protectora.

¡Solo para uso en investigación!

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