Kit Maxiprep de plásmido

Utilizando el método clásico de lisis alcalina y la unión reversible de la membrana de gel de sílice al ácido nucleico, el kit puede extraer 500 ug ~ 1500 ug de ADN plasmídico de Escherichia coli cultivada durante la noche con 100 ml. El plásmido extraído se puede utilizar directamente en diversos experimentos de biología molecular, como reacciones de digestión con enzimas de restricción, reacciones de ligación, amplificación por PCR, secuenciación, transformación, etc.

La RNasa A se envía con hielo húmedo y se almacena a -20 grados. Otros reactivos se envían y almacenan a temperatura ambiente; Válido por 12 meses.

1. Se requieren etanol anhidro y un tubo de centrífuga sin nucleasa de 50 ml, pero no se suministran en este kit.

2. Agregue toda la RNasa A proporcionada en el kit al Tampón P1 antes de su uso y puede almacenarse entre 2 y 8 grados durante 6 meses.

3. Agregue 75 ml de etanol anhidro al tampón PD y 163 ml de etanol anhidro al tampón PW antes de su uso.

4. Si el tampón P2 precipita, caliéntelo en un baño de agua a 37 grados durante unos minutos para restablecer la clarificación. Después de usar Buffer P2, la tapa debe cerrarse inmediatamente para evitar el contacto prolongado con el aire.

5. Enfríe previamente el tampón P3 a 4 grados o en un baño de hielo antes de usarlo.

1. Equilibrio de la columna: agregue 2,5 ml de tampón BL a la columna de ADN HiBind, centrifugue a 10,000×g durante 2 minutos, deseche el filtrado y vuelva a colocar la columna de ADN HiBind en el tubo de recolección (las columnas tratadas se mejor usarlo el mismo día).

2. Recoja el cultivo bacteriano de 100 ml de líquido bacteriano fresco mediante centrifugación a 10,000×g durante 1 min a temperatura ambiente. Recoger el cultivo en el tubo de centrífuga de 50 ml (eliminar el sobrenadante tanto como sea posible). Los plásmidos con copia baja o más de 10 kb sugieren recolectar bacterias cultivadas durante la noche con 200 ml, y se debe aumentar la dosis de Buffer P1, Buffer P2 y Buffer P3 en igual proporción.

3. Agregue 8 ml de tampón P1 (compruebe si desea agregar o no la RNasa A primero), use una pipeta o un oscilador de vórtice para suspender completamente las bacterias (asegúrese de dispersar completamente las bacterias, de lo contrario afectará la lisis, lo que resultará en baja calidad y pureza del plásmido extraído).

4. Agregue 8 ml de tampón P2, inmediatamente y gírelo suavemente de 8 a 10 veces para lisar completamente las bacterias (este paso no debe agitarse violentamente y debe realizarse en 5 minutos). En este punto, la solución debe volverse transparente y pegajosa, si no se vuelve transparente, puede ser que haya demasiadas bacterias y la lisis no esté completa, se puede revertir suavemente de 5 a 8 veces nuevamente hasta que la solución esté completamente claro.

5. Agregue 8 ml de tampón P3 (preenfriado a 4 grados de anticipación), inmediatamente y suavemente boca abajo 10 a 12 veces, la solución parece un aglomerado compacto, centrifugue a 10,000×g durante 10 a 15 minutos. a temperatura ambiente, vierta lentamente el sobrenadante en el filtro de columna, empuje la manija para filtrar y el filtrado se recoge en un tubo de centrífuga de 50 ml sin nucleasa (proporcionado por el propio fabricante).

6. Agregue etanol anhidro 0.5 veces el volumen de la solución anterior, mezcle boca abajo y transfiera a la columna de ADN HiBind (no más de 10 ml cada vez).

7. Centrifugar a 10,000×g durante 2 min a temperatura ambiente, desechar el filtrado. Vuelva a colocar la columna de ADN HiBind en el tubo de recolección (la solución del paso 6 se puede pasar a través de la columna muchas veces).

8. Agregue 10 ml de tampón PD (confirme si desea agregar etanol anhidro) a la columna de ADN HiBind, centrifugue a 10,000×g durante 2 minutos a temperatura ambiente y deseche el filtrado. Vuelva a colocar la columna de ADN HiBind en el tubo de recolección.

9. Agregue 10 ml de tampón PW (confirme si desea agregar o no etanol anhidro) a la columna de ADN HiBind, centrifugue a 10,000×g durante 2 minutos a temperatura ambiente y deseche el filtrado. Vuelva a colocar la columna de ADN HiBind en el tubo de recolección.

10. Repita el paso 9.

11. Centrifugar a 10,000×g durante 5 minutos a temperatura ambiente, colocar la columna de ADN HiBind en un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml sin nucleasas. Abra la tapa y colóquela durante 10 minutos a temperatura ambiente para volatilizar completamente el etanol.

12. Agregue 1 ~ 1,5 ml de tampón TE o agua libre de nucleasas al centro de la membrana y colóquela a temperatura ambiente durante 5 minutos. Centrifugar a 10,000×g durante 5 min. Si necesita aumentar la eficiencia de la recuperación del plásmido, la solución obtenida se puede volver a agregar a la columna de ADN HiBind, colocarla a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifugar a 10,000xg durante 5 minutos.

13. El ADN plasmídico obtenido se puede conservar durante mucho tiempo en grado -20.

1. Lea atentamente el Manual del producto antes de usarlo.

2. Si el número de copias del plásmido es bajo o el ADN del plásmido mide más de 10 kb, se recomienda recolectar el cultivo nocturno de 200 ml y se debe aumentar la dosis de Tampón P1, Tampón P2 y Tampón P3 en igual proporción.

3. El tampón TE se puede precalentar a 60 ~ 65 grados y el tiempo de incubación de elución se puede prolongar para mejorar la eficiencia de la elución.

4. El etanol debe volatilizarse completamente antes de eluir el plásmido para evitar la influencia del etanol residual en los experimentos posteriores.

5. Por su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables.

¡Solo para uso en investigación!

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