Kit de minipreparación de ADN plasmídico de alta pureza

Este kit adopta el método de lisis mejorado a base de SDS, la solución de lisis optimizada puede hacer que la columna de adsorción centrífuga se una específicamente al ADN en solución en un estado alto de sal, combinado con la avanzada tecnología de adsorción de membrana de gel de sílice, puede lograr el propósito de una rápida purificación de ADN plásmido. Adecuado para extraer hasta 25 ug de ADN plasmídico de alta pureza de 1-5 ml de cultivo bacteriano. Este kit elimina proteínas impurezas y otros compuestos orgánicos de las células. La velocidad y la calidad de la extracción de plásmidos están relacionadas con las especies de bacterias hospedadoras y las condiciones de cultivo, la lisis celular, el número de copias de plásmidos, la estabilidad de los plásmidos, los antibióticos y otros factores. La solución contiene indicadores para indicar si la resuspensión, lisis y neutralización están completas mediante su cambio de color, a fin de garantizar la calidad de la extracción del plásmido y visualizar el proceso operativo. El ADN plasmídico extraído con este kit se puede aplicar a digestión enzimática, PCR, secuenciación, ligación, transformación, selección de bibliotecas, traducción in vitro, etc.

La RNasa A se envía con hielo húmedo y se almacena a -20 grados; el resto de reactivos se envían y almacenan a temperatura ambiente; Válido por 12 meses.

1. Compruebe si hay un precipitado blanco en el tampón BL, el tampón S2, el tampón S3 y el tampón PD. Si está presente, coloque el tampón en un baño de agua a 37 grados durante unos minutos hasta que la solución se aclare.

2. Agregue toda la solución de RNasa A al tampón S1 (rojo) y mezcle. La solución de resuspensión debe almacenarse a 4 grados.

3. Verifique que se agregue la cantidad especificada de etanol anhidro antes de usar Buffer PW.

4. Para el paso de equilibrio de columnas, Buffer BL puede mejorar la capacidad de unión, la homogeneidad y la estabilidad de las minicolumnas Bind DNA y eliminar la influencia de las altas temperaturas, la humedad u otros factores ambientales adversos en las minicolumnas Bind DNA.

5. Protocolo de ensayo / Procedimientos

6. Saldo de columnas:

a. Coloque las minicolumnas Bind DNA en los tubos de recolección;

b. agregue 500 μL de tampón BL a las minicolumnas Bind DNA, centrifugue a 10,000 xg durante 1 min, deseche el flujo de las columnas;

do. Vuelva a colocar las minicolumnas Bind DNA en los tubos de recogida (utilice las columnas recién tratadas ese mismo día).

1. Recolección de bacterias: Centrifugue 1-5 ml de cultivo bacteriano fresco durante la noche a 10,000 rpm durante 1 minuto y aspire el sobrenadante tanto como sea posible (cuando haya una gran cantidad de bacterias, puede recolectar el precipitado bacteriano en un solo tubo de centrífuga centrifugando varias veces).

2. Resuspensión: Resuspenda el sedimento celular completamente en 250 µL de tampón S1 (asegúrese de que se haya agregado ARNasa A antes de usarlo) agitando o pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Después de mezclar, la solución adquiere un color rojo turbio y se deja reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Nota: asegúrese de que no queden grupos bacterianos después de la lisis. De lo contrario, afectará el procedimiento de lisis, lo que dará como resultado una cantidad y pureza de extracción bajas.

3. Lisis: agregue 250 µL de tampón S2 y mezcle suavemente invirtiendo el tubo 6-8 veces para lisar completamente las bacterias.

Nota: mezcle bien suavemente, no agite violentamente; La mezcla parece clara y viscosa. De lo contrario, puede deberse a demasiadas bacterias y a una lisis incompleta; reduzca el volumen del cultivo bacteriano. Después de agregar el tampón S2 y mezclar bien, el color de la solución es violeta claro; si hay un color rojo turbio mezclado con el color violeta, la escisión es insuficiente, continúe mezclando hasta que el color de la solución cambie completamente a violeta claro; Se recomienda que la escisión esté a temperatura ambiente por no más de 5 min.

1. Neutralización: agregue 350 µL de tampón S3 al tubo de centrífuga y mezcle inmediata y completamente invirtiendo el tubo 6-8 veces. Aparecerá un precipitado floculento y se centrifuga a 13,000 g durante 10-15 min.

2. Nota: El tampón S3 debe mezclarse inmediatamente después de agregarlo, y una pequeña cantidad de un pequeño precipitado blanco en el sobrenadante no tiene ningún efecto en experimentos posteriores; Había una gran cantidad de un pequeño precipitado blanco en el sobrenadante, y el sobrenadante se pudo tomar nuevamente después de la centrifugación. Después de agregar el tampón S3 y mezclar bien, la solución es de color amarillo claro. Si hay púrpura mezclado con amarillo, indica que la renaturalización no es suficiente. Continúe mezclando hasta que la solución adquiera un color amarillo completamente transparente), el sobrenadante recogido se transfirió a las minicolumnas Bind DNA, teniendo cuidado de no pipetear la precipitación tanto como fuera posible. Después de centrifugar nuevamente a 10,000 g durante 1 min, se descartó el líquido residual y se colocaron las minicolumnas Bind DNA en los tubos de recolección.

3. Agregue 500 µL del tampón PD a las minicolumnas Bind DNA. Centrifugar a 10,000 g durante 1 minuto y desechar el flujo. Coloque las columnas nuevamente en los mismos tubos de recolección.

4. Agregue 700 µL del tampón PW (verifique si se ha agregado etanol al 100 % antes de usarlo) a las minicolumnas Bind DNA, centrifugue a 10,000 g durante 1 min, deseche el flujo, coloque Vuelva a colocar las minicolumnas Bind DNA en los mismos tubos de recogida.

5. Nota: Si el ADN recuperado se utiliza para experimentos sensibles a la sal, como un experimento de unión de extremos planos o secuenciación directa, se recomienda agregar el tampón PW y dejarlo reposar durante 2-5 minutos antes de la centrifugación.

6. Repita el paso 7.

4. Vuelva a colocar las minicolumnas Bind DNA en los mismos tubos de recolección y centrifugue a 10,000 xg durante 2 minutos para eliminar los residuos. Coloque las minicolumnas Bind DNA a temperatura ambiente durante 5 minutos y séquelas completamente.

7. Nota: el etanol residual en la solución de enjuague afectará la digestión enzimática posterior y los experimentos de PCR).

8. Para eluir el ADN plasmídico, transfiera las minicolumnas Bind DNA a un tubo de microcentrífuga estéril y agregue 50 ~ 100 μL de tampón de elución o agua estéril (precaliente el tampón de elución o ddH2O a 60-65 grados para obtener mejores resultados) directamente a la resina. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue los tubos de recolección/columna Mini Bind DNA a temperatura ambiente a 10,000 g durante 2 minutos. El ADN plasmídico ahora se eluye de la columna.

9. Nota: El volumen de la solución de elución no debe ser inferior a 50 μL y un volumen demasiado pequeño afectará la eficiencia de la recuperación. Para aumentar la cantidad de ADN recuperado, la solución obtenida por centrifugación se puede volver a llenar en las minicolumnas Bind DNA, se deja a temperatura ambiente durante 2 minutos, se centrifuga a 10,000 g durante 2 minutos y se Solución de ADN recogida en el tubo de centrífuga. El pH del eluyente tiene un gran impacto en la eficiencia de elución. Si la secuenciación se va a realizar posteriormente, se recomienda utilizar ddH2O como eluyente y asegurarse de que su pH esté en el rango de 7,0-8.5; un pH inferior a 7,0 reducirá la eficacia de elución; El producto de ADN debe almacenarse a -20 grado para evitar la degradación del ADN.

1. La cantidad de plásmido extraído se relacionó con la concentración del cultivo bacteriano y el número de copias del plásmido. Si el plásmido es un plásmido de pocas copias o un plásmido grande de más de 10 KB, se debe aumentar la cantidad de bacterias (5-10 ml para cultivo bacteriano nocturno) y se debe aumentar proporcionalmente la cantidad de tampón S1, S2 y S3. El tampón de elución debe precalentarse a 60-65 grados en un baño de agua, lo que puede prolongarse adecuadamente durante la adsorción y la elución para lograr una extracción eficaz. Otros pasos son los mismos.

1. Apriete la tapa inmediatamente después de usar cada solución para evitar que el solvente se evapore.

2. Para su seguridad y salud, use gafas de seguridad, guantes o ropa protectora.

¡Solo para uso en investigación!

Etiqueta: kit de minipreparación de ADN plasmídico de alta pureza, fabricantes, proveedores, fábrica de kit de minipreparación de ADN plasmídico de alta pureza de China