Higromicina B (50 mg/ml)

La higromicina B es un antibiótico aminoglucósido producido por el metabolismo de Streptomyces suis. La higromicina B mata células procariotas (bacterianas), eucariotas (p. ej., levaduras, hongos) y eucariotas de mamíferos superiores al interferir con las translocaciones ribosómicas 70S e inducir una lectura errónea de las plantillas de ARNm y, por lo tanto, inhibir la síntesis de proteínas.

Los genes de resistencia a la higromicina derivados de E. coli (hyg o hph), que codifican las fosfotransferasas de higromicina B, desintoxican la higromicina B convirtiéndola en un producto fosforilado biológicamente inactivo. En respuesta a este principio, la higromicina B es un marcador de selección de resistencia muy útil que puede usarse para detectar y mantener en cultivo células procariotas o eucariotas que han sido transfectadas exitosamente con genes de resistencia a la higromicina. Además, a menudo se utiliza en combinación con G418 para la selección de líneas celulares positivas para resistencia dual debido a diferencias en el modo de acción.

Este producto es una solución estéril de higromicina B (50 mg/mL), que se puede diluir directamente con medio de cultivo para su uso. La concentración de trabajo comúnmente utilizada es 200-500 ug/mL. Para el uso por primera vez en sistemas experimentales, se recomienda determinar la concentración de detección óptima estableciendo una curva dosis-respuesta.

Enviar con hielo mojado. Almacenar a 2-8 grado durante 24 meses.

1. Determinación de una curva dosis-respuesta de higromicina B:

Para las células utilizadas por primera vez, generalmente es necesario determinar experimentalmente una curva dosis-respuesta (curva dosis-respuesta o curva de muerte) que sea apropiada para su sistema experimental.

1) Día 1: 24-placas de pocillos se inocularon con células no transfectadas a una densidad de 5~8×10⁴células/pocillo, inoculando un número suficiente de pocillos para posteriores experimentos de gradiente de dosis. Las células se cultivaron durante la noche en una incubadora de cultivo celular.

2) Día 2: Reemplace las células después de la incubación durante la noche con medio de detección recién preparado que contenga diferentes concentraciones de higromicina B (por ejemplo, 0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ug/ml, etc.), y Continuar la incubación en una incubadora de cultivo celular después de reemplazar el medio. A continuación, el medio se reemplazó con medio nuevo que contenía antibióticos cada 3-4 días.

3) Se realizaron recuentos de células vivas a intervalos fijos para determinar la concentración adecuada para bloquear el crecimiento de células no transfectadas, y se seleccionó la concentración más baja que mató a la mayoría de las células en 7-10 días como concentración de trabajo para la detección de células estables. células transfectadas.

2. Detección de células transfectadas de forma estable:

Las cepas de expresión estable pueden seleccionarse después de la transfección de un plásmido que contiene el gen de resistencia o de la infección con un virus que contiene el gen.

1) Las células se transfectaron o infectaron durante 48 h y luego se cultivaron en medio nuevo que contenía la concentración adecuada de higromicina B.

Nota: El efecto antibiótico es más pronunciado cuando las células se encuentran en la fase activa de división. Si las células son demasiado densas, la eficacia del antibiótico se reducirá significativamente, por lo que es mejor mantener la densidad de las células en no más del 25%. Se recomienda realizar un grupo de control de células normales al mismo tiempo. Después de 48 h de transfección o infección, si las células son demasiado densas, también puede volver a inocularlas después de la digestión e incubarlas durante la noche para la detección de higromicina B.

2) Cada 3-4 días, reemplace el medio con medio nuevo que contenga antibióticos.

3) Después de 7 días de detección, el 100% de las células normales del grupo de control deberían estar muertas y las células supervivientes del grupo transfectado son aquellas que expresan el gen de resistencia a la higromicina B. Luego busque células policlonales o monoclonales según el propósito experimental.

4) Los clones resistentes estables seleccionados continuaron manteniéndose en medio de detección que contenía el fármaco durante 7-10 días, después de lo cual simplemente se reemplazó el medio normal.

¡Solo para uso en investigación! ¡No apto para uso en procedimientos de diagnóstico!

Ver. No.:V1.0-202301

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