Kit de viabilidad de levaduras/bacterias vivas o muertas（SYTO-9/PI）

El kit de viabilidad bacteriana viva o muerta (SYTO-9/PI) es un kit conveniente que utiliza colorante de ácido nucleico verde SYTO-9 y yoduro de propidio (PI).

Colorante rojo fluorescente de ácido nucleico para detectar la viabilidad bacteriana. Se puede analizar mediante análisis fluorescente, como microplacas de fluorescencia.

Lectores, citometría de flujo y microscopio de fluorescencia. Aplicable a una variedad de bacterias Gram negativas y Gram positivas, incluidas Escherichia coli, Bacillus subtilis, micrococcus lysoides, etc. Además, este kit también se puede utilizar para teñir la vitalidad de la levadura.

Los kits contienen dos tintes fluorescentes, SYTO-9 y yoduro de propidio (PI). SYTO-9 es un tinte fluorescente de ácido nucleico verde que puede teñir bacterias con membranas intactas y dañadas. El PI es un tinte fluorescente de ácido nucleico rojo que tiñe solo las bacterias muertas con membranas dañadas, pero la adición de PI provoca una disminución en la fluorescencia de la tinción con SYTO-9. Cuando se agregaron dos tintes a la suspensión bacteriana al mismo tiempo, el ajuste apropiado de la proporción de SYTO-9 y PI podría hacer que las bacterias con la estructura de la membrana intacta emitan fluorescencia verde, mientras que las bacterias con la estructura de la membrana dañada emitan fluorescencia roja. Las longitudes de onda máximas de excitación y emisión de los dos tintes combinados con ácido nucleico fueron 485/530 nm (SYTO-9) y 485/630 nm (PI), respectivamente.

Empaque el transporte con hielo húmedo; Almacenar a -20 grados y protegido de la luz durante 12 meses.

Con las diluciones y volúmenes de reactivos recomendados, el kit contiene suficiente material para realizar:

40 pruebas individuales mediante ensayo de citometría de flujo: se agregaron 500 μL de suspensión bacteriana a 1 μL de mezcla de colorante (SYTO 1 μL +PI 1 μL);

200 pruebas individuales mediante lectores de microplacas y ensayo de microscopio de fluorescencia: se agregaron 100 μl de solución de bacterias a 1 μl de tinte diluido (SYTO 1 μl + PI 1 μl+0.85% Nacl 8 μl).

【Nota】: Los ácidos nucleicos y otros componentes de los medios pueden unirse a SYTO{{0}} y PI de manera impredecible, lo que resulta en una gran diferencia de tinción con respecto a los resultados esperados. Por lo tanto, es necesario eliminar los residuos del medio y los tampones de fosfato parecen disminuir la eficiencia de la tinción, se recomienda una solución de Nacl al 0,85%. Durante el proceso experimental, si se descubre que la eficiencia de la tinción con fluorescencia verde es demasiado baja o la fluorescencia roja es demasiado baja. demasiado alta, la intensidad de la fluorescencia se puede ajustar al efecto esperado aumentando apropiadamente el volumen del tinte verde o reduciendo el volumen del tinte rojo.

Preparación de bacterias vivas/muertas (por ejemplo, Escherichia coli, referencia para la relación de viabilidad bacteriana, opcional)

(1) Se cultivó Escherichia coli hasta la fase logarítmica tardía en caldo nutritivo LB.

(2) Las bacterias se dividieron en dos partes con tubos EP y una parte se centrifugó a 8000 g durante 10 minutos (la otra parte se colocó a temperatura ambiente para preparar bacterias vivas).

(3) Retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en la cantidad adecuada de 0.85 % de NaCl, luego agregue una cantidad adecuada de etanol para lograr que la concentración final de etanol al 70 % se mezcle completamente. Es necesario incubar a temperatura ambiente durante 1 h, mezclar cada 15 minutos y prepararlo para las bacterias muertas.

(4) Concentrar ambas muestras mediante centrifugación a 8000 xg durante 10 minutos.

(5) Retire el sobrenadante, agregue una cantidad adecuada de 0.NaCl al 85% a las dos muestras para resuspender las bacterias, centrifugue nuevamente como en el paso 4 y resuspenda.

(6) Determine la densidad óptica a 670 nm (DO670) de ambas muestras mediante espectrofotómetro.

(7) La densidad óptica de las dos suspensiones bacterianas (vivas y muertas) a OD670 fue 0.03~0,1.

(8) Como se muestra a continuación, para obtener la proporción deseada de células vivas/células muertas mezclando las dos suspensiones bacterianas.

(1) Centrifugar las bacterias a 8000 g durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, agregar una cantidad adecuada de NaCl al 0,85 % para resuspender las bacterias, repetir la centrifugación nuevamente y resuspender en un recipiente apropiado. cantidad de NaCl al 0,85%.

(2) Ajuste la densidad óptica bacteriana, como E. coli, con OD670 entre 0.03 y 0,1.

(3) Se mezclaron completamente 1 volumen de SYTO-9 y 1 volumen de PI en un tubo de microcentrífuga. Luego se agregaron 8 volúmenes de 0.Solución de NaCl al 85% para obtener una solución de tinte 100X.

(4) Por cada 100 µL de suspensión bacteriana, agregue 1 µL de solución de tinte 100X.

(5) Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos, protegido de la luz.

(6) Tome 5 μl de gotas de suspensión bacteriana teñidas en el portaobjetos y luego cúbralo suavemente con un portaobjetos cuadrado de 18 mm.

(7) Las bacterias vivas (fluorescencia verde) y las bacterias muertas (fluorescencia roja) se pueden observar y obtener imágenes utilizando los canales FITC y Cy3 bajo un microscopio de fluorescencia, respectivamente.

(1) Centrifugar las bacterias a 8000 g durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, agregar una cantidad adecuada de NaCl al 0,85 % para resuspender las bacterias, repetir la centrifugación nuevamente y resuspender en un recipiente apropiado. cantidad de NaCl al 0,85%.

(2) Ajuste la densidad óptica bacteriana, como E. coli, con OD670 entre 0.03 y 0,1.

(3) Se mezclaron completamente 1 volumen de SYTO-9 y 1 volumen de PI en un tubo de microcentrífuga. Luego se agregaron 8 volúmenes de 0.Solución de NaCl al 85% para obtener una solución de tinte 100X.

(4) Agregue 1 μL de solución de tinte 100X a cada 100 μL de suspensión bacteriana en una placa de pocillos 96- de fondo plano.

(5) Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz.

(6) Medición de fluorescencia y análisis de datos.

① Mida la fluorescencia de cada pocillo utilizando una longitud de onda de excitación de ~485 nm y una longitud de onda de emisión de ~530 nm (emisión 1, verde);

② Mida la fluorescencia de cada pocillo utilizando una longitud de onda de excitación de ~485 nm y una longitud de onda de emisión de ~630 nm (emisión 2, rojo);

③ Calcule la relación de fluorescencia=emisión 1/emisión 2;

④ Trace un gráfico lineal con la proporción de células vivas de E. coli en la suspensión como eje x y la relación emisión 1/emisión 2 como eje y.

(1) Centrifugar las bacterias a 8000 g durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, agregar una cantidad adecuada de NaCl al 0,85 % para resuspender las bacterias, repetir la centrifugación nuevamente y resuspender en un recipiente apropiado. cantidad de NaCl al 0,85%.

(2) Ajuste la densidad óptica bacteriana, como E. coli, con OD670 entre 0.03 y 0,1.

(3) Se mezclaron completamente 1 volumen de SYTO-9 y 1 volumen de PI en un tubo de microcentrífuga. Luego se agregaron 8 volúmenes de 0.Solución de NaCl al 85% para obtener una solución de tinte 100X.

(4) Agregue 5 μL de la mezcla de tinte por cada 500 μL de suspensión bacteriana.

(5) Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos, protegido de la luz.

(6) Para análisis de citometría de flujo: utilice el canal FITC para detectar la fluorescencia SYTO-9 (células verdes, vivas) y utilice el canal PE/PC5.5 para detectar la fluorescencia del yoduro de propidio (PI) (rojo, muerto). células).

1. Dado que los componentes SYTO-9 y yoduro de propidio (PI) son limitados, asegúrese de centrifugar a baja velocidad antes de abrir la tapa para evitar pérdidas.

2. Después del primer uso, puede dividir los tintes en porciones más pequeñas para almacenarlos y evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación y contaminación.

3. SYTO-9 y PI son soluciones de almacenamiento con una capacidad de 1000×, que han sido optimizadas para ser adecuadas para la mayoría de las bacterias. Sin embargo, para obtener resultados más satisfactorios, realice ciertas pruebas de concentración para diferentes tipos de bacterias. La concentración final para el uso de SYTO-9 y PI es generalmente 0,5-2×, siendo la concentración final más alta recomendada 1×. Por ejemplo, al teñir levadura, SYTO-9 recomienda una concentración final de 1× y PI recomienda una concentración final de 2×.

4. Para E. coli, la densidad óptica recomendada (OD670) es 0.03-0.1. Para las esporas de Bacillus subtilis, la OD67{{10}} recomendada es 0.01-0.1. Para Micrococcus luteus, la OD670 recomendada es 0.01-0.1. Para la levadura, la OD670 recomendada es 0.1-0.3.

5. Para su seguridad y salud, use una bata de laboratorio y guantes desechables cuando opere.

¡Solo para uso en investigación!

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