Kit de ensayo de proliferación celular Click-iT EdU-594

Es un método de evaluación común e importante en las ciencias biológicas para juzgar la influencia de ciertos genes, fármacos, etc. en células cultivadas in vitro mediante el análisis de la capacidad de proliferación celular, o para analizar la capacidad de crecimiento y renovación de células de tejido individuales en diferentes estados. o intervenciones de estimulación. . En la actualidad, existen muchos métodos para detectar la proliferación celular. La mayoría de ellos utilizan algunas enzimas metabólicas producidas por las células para evaluar indirectamente la actividad de proliferación de las células (como el método CCK-8, el método MTT, etc.), pero algunos fármacos o el estado de las propias células tendrán un cierto impacto. sobre los resultados de la evaluación. La detección directa de la síntesis de ADN en las células para determinar la proliferación celular se reconoce como el método de detección más preciso y eficaz. Sin embargo, tanto el método de incorporación de nucleósidos radiomarcados utilizado inicialmente como el método BrdU mejorado posterior basado en la detección de anticuerpos tienen ciertas limitaciones.

EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) es un análogo de timidina que contiene un grupo acetileno que, cuando se inyecta en animales o se incuba con células in vitro, estas pequeñas moléculas pueden difundirse rápidamente en varios órganos y tejidos, penetrar en las células y puede incorporarse al ADN recién sintetizado en lugar de timidina (T) durante la proliferación celular. El grupo acetileno en la molécula EdU puede sufrir una reacción de "clic" con la sonda de azida marcada con fluorescencia bajo la catálisis de iones de cobre para formar un anillo de triazol estable, de modo que el ADN recién sintetizado se puede marcar con la sonda fluorescente correspondiente. En comparación con el método de incorporación de nucleósidos radiomarcados, el método de detección EdU no tiene limitaciones como la contaminación radiactiva; En comparación con el método de detección BrdU, el método de detección EdU no requiere tratamiento de desnaturalización del ADN ni reacción antígeno-anticuerpo, lo que reduce en gran medida la complejidad del experimento y el tiempo, y lo hace más eficiente en el tiempo, más receptivo y más. estable y más preciso. Este kit se puede utilizar para detectar la proliferación celular en células cultivadas in vitro o en tejidos animales. La sonda fluorescente de este kit es de fluorescencia roja con una longitud de onda de excitación máxima de 593 nm y una longitud de onda de emisión máxima de 614 nm. Una vez marcadas las células en proliferación, el núcleo mostrará una fluorescencia de color rojo brillante y los núcleos se marcarán con un tinte nuclear convencional (en este kit se proporciona el tinte nuclear Hoechst 33342). La intensidad de la fluorescencia de la población de células cultivadas in vitro también se puede detectar mediante citometría de flujo, y la actividad de replicación del ADN en la fase S del ciclo celular se puede juzgar según la intensidad de la fluorescencia.

Transporte con hielo húmedo; guárdelo a -20 grados en la oscuridad. El reactivo catalítico EdU (reactivo A) y el tampón de reacción se pueden almacenar a 4 grados; el período de validez es de 12 meses.

Nota: Los tiempos de reacción anteriores corresponden a la detección de 96-placa de pocillos.

1. Medio de cultivo celular que contiene suero;

2. Solución de permeabilización: tampón que contiene 0.2-0.5% Triton X-100 (recomendado G1204);

3. Fijador: 4% de paraformaldehído (recomendado G1101) u otros reactivos similares;

4. Tampón PBS (recomendado G4202);

5. Agua ultrapura;

6. Reactivos relacionados con el modelado animal y la sección de tejidos (detección de proliferación de células de tejidos animales).

1. Muestras de células in vitro y preparación de reactivos:

1.1. Las células se plantan uniformemente en la placa de cultivo celular a una cierta densidad (la densidad de siembra está determinada por factores como el tamaño de las células, la velocidad de crecimiento, etc.), y después de que las células se adhieran a la pared o vuelvan a un estado normal, se realizan estimulación farmacológica correspondiente y otros tratamientos (como la detección de células en suspensión, siga el funcionamiento rutinario de las células en suspensión, y todo el experimento debe agregar pasos como la centrifugación).

1.2. El aditivo catalítico (reactivo C) se centrifugó a baja velocidad, se disolvió en 1 ml de agua ultrapura y se almacenó a -20 grado para su uso posterior.

2. Marcado EdU, fijación y permeabilización de células in vitro:

2.1. Prepare una solución de trabajo de incubación EdU 2×: agregue 2 μL de solución madre de EdU (10 mM) a cada 1 ml de medio de cultivo celular completo, que es una solución de trabajo de incubación EdU 2× 20 μM, y colóquelo en una incubadora para precalentarlo (es se recomienda explorar con una concentración de trabajo de EdU de 10 μM en experimentos preliminares);

2.2. En el modo de medio intercambio de medio, la mitad del medio de cultivo celular original en la placa de cultivo se eliminó mediante succión y se añadió un volumen igual de solución de trabajo de incubación 2xEdU precalentada durante un cierto período de tiempo (el tiempo de incubación generalmente depende del crecimiento celular correspondiente). El ciclo celular suele representar aproximadamente el 10% del ciclo celular. Para la mayoría de las células adherentes y de rápido crecimiento, se recomienda incubar durante aproximadamente 2 horas. La situación específica debe ajustarse según las características de las células y la situación real después del tratamiento. Si necesita incubar durante más tiempo La concentración de trabajo de EdU se puede reducir adecuadamente durante un corto período de tiempo; la concentración de EdU se puede aumentar adecuadamente durante un período de tiempo más corto);

2.3. Lave las muestras de células incubadas y marcadas con EdU con tampón PBS 1-2 veces, agregue fijador para cubrir las células y fíjelas a temperatura ambiente durante 15 minutos (si se requiere detección de flujo, adjunte las células antes de este paso. Digerir y resuspender y luego fijar, y luego seguir el método de tratamiento de células suspendidas); lavar 2-3 veces con tampón PBS, 3-5 min cada vez;

2.4. Retire el tampón PBS, agregue la solución de permeabilización para cubrir las células o tejidos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos;

2.5. Después de retirar el permeabilizador, lave 1-2 veces con tampón PBS durante 3-5 minutos cada vez y luego vaya al paso 4.

3. Modelado de inyección de Animal EdU y procesamiento de secciones de tejido:

3.1. De acuerdo con los requisitos experimentales, se realizaron una o más inyecciones de EdU en animales mediante inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea e inyección en la vena de la cola. La cantidad depende del contenido de la investigación y de las condiciones de los animales. Este kit proporciona algunas soluciones de almacenamiento EdU, que se utilizan principalmente para el etiquetado EdU de células in vitro. Si se requiere modelado EdU para animales, los reactivos EdU (recomendado G5059) se pueden pedir por separado;

3.2. Las células del tejido epitelial, como las del intestino delgado, proliferan rápidamente y las células del tejido, como las del cerebro, proliferan lentamente. Las partes de tejido de crecimiento rápido generalmente se marcan durante menos de 12 horas, mientras que el tejido de crecimiento lento puede tardar varios días en marcarse; el mejor tiempo de marcado se basa en Depende del experimento específico. Debido a la rápida proliferación del tejido epitelial del intestino delgado, se recomienda tomar este tipo de tejido como marcador de referencia;

3.3. Después de sacrificar los animales modelo de acuerdo con los estándares prescritos, se extrajeron los tejidos necesarios y se realizaron secciones congeladas o en parafina de acuerdo con los procedimientos de rutina;

a. Para secciones congeladas: volver a temperatura ambiente, agregar una cantidad adecuada de fijador y fijar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Retire el fijador y lave 3 veces con una cantidad adecuada de tampón PBS durante 3-5 min cada vez; retirar el tampón PBS, utilizar una cantidad adecuada de solución de permeabilización e incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min; retire la solución de permeabilización y lave con tampón PBS 1- 2 veces, 3-5 min cada vez, luego vaya al paso 4.

b. Para cortes en parafina: Desparafinar los cortes, rehidratar y lavar con PBS durante 5 min. Retire el tampón PBS, agregue la solución de permeabilización, cubra las células o tejidos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos; después de retirar la solución de permeabilización, lave con tampón PBS 1-2 veces durante 3-5 minutos cada vez y luego vaya al paso 4.

4. Respuesta al clic de EdU:

4.1. Durante la fijación y perforación de células o tejidos, prepare la solución de reacción de clic (consulte el protocolo en la tabla siguiente para conocer los diferentes sistemas de preparación de muestras)

Para células cultivadas in vitro: este paso de referencia corresponde al volumen de 10 96-muestras de placas de pocillos (100 μl por pocillo). El volumen de preparación se puede aumentar o disminuir en proporciones iguales según las necesidades de uso. Agregue los componentes en el orden que se muestra en la tabla. Agregue el borde y mezcle bien (actualmente preparado y usado);

Para cortes de tejido y células: consulte el sistema siguiente para preparar la solución de reacción de clic. El volumen de preparación se puede aumentar o disminuir en proporciones iguales según el número de muestras cortadas. Cada muestra de corte se cubre con aproximadamente 100-200 μL de solución de reacción de clic.

4.2. Retire el tampón PBS en el paso anterior (paso 2.5 o 3.3), agregue la solución de reacción de clic, agite suavemente para garantizar que la solución de reacción cubra completamente las células o tejidos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad;

4.3. Retire la solución de reacción de clic y lave con tampón PBS 2-3 veces durante 3-5 min cada vez (si no hay otros requisitos especiales, la intensidad de la fluorescencia se puede detectar mediante un citómetro de flujo o se puede detectar el efecto de fluorescencia). por otros instrumentos).

5. Tinción de núcleos:

5.1. Retire el tampón PBS del paso anterior, diluya la solución de tinción Hoechst 33342 y el tampón PBS en una proporción de 1:500-1000, agregue las células de cobertura e incube durante 5 minutos;

5.2. Retire la solución de tinción Hoechst 33342 y lave con tampón PBS 2-3 veces, 3-5 min cada vez.

6. Análisis de imágenes y detección.

Coloque directamente las células cultivadas in vitro o muestras de cortes de tejido en un microscopio de fluorescencia o microscopio confocal y otros instrumentos de detección para analizar la proporción de células en proliferación; o recolectar células cultivadas in vitro y usar un citómetro de flujo para detectar la intensidad de la fluorescencia (se recomienda usar una muestra de células marcadas con EdU como control negativo para la detección por citometría de flujo y se seleccionó un voltaje apropiado), y el La actividad de replicación del ADN en la fase S del ciclo celular se juzgó según la intensidad de la fluorescencia. Las propiedades espectrales correspondientes al tinte fluorescente iF594 (reactivo B) de este kit son Ex/Em: 593 nm/614 nm (rojo); las propiedades espectrales correspondientes a la solución de tinción Hoechst 33342 son Ex/Em: 346 nm/460 nm (azul)

1. Para células cultivadas in vitro, la concentración de EdU específica y el tiempo de incubación se pueden ajustar adecuadamente según la muestra y el propósito de la investigación.

2. Algunas células de los tejidos proliferan lentamente. Para excluir factores como un efecto de modelado deficiente, se recomienda seleccionar muestras de tejido con proliferación rápida como muestras de referencia (como el tejido intestinal).

3. Si el color de fondo es demasiado oscuro, puede deberse a un lavado insuficiente en el experimento, un tiempo de fijación prolongado de las muestras de tejido y fijador residual.

4. El reactivo de adición catalítica de EdU (reactivo C) se oxida fácilmente; trate de evitar la exposición prolongada al aire. Después de prepararlo en una solución acuosa, se recomienda almacenarlo en paquetes separados; Después de la prueba, si el color del reactivo de adición catalítica de EdU cambia ligeramente, el sistema catalítico de reacción de clic sigue siendo el mismo. Se puede realizar normalmente, si se pone marrón indica que el componente ha fallado, por favor deséchelo.

5. Utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

¡Solo para uso en investigación!

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