Kit de detección de ciclo celular y apoptosis

 

Nombre del producto	Cat.No	Especulación.
Kit de detección de ciclo celular y apoptosis	G1700-50T	50 T

 

 

El ciclo celular se refiere a todo el proceso de la célula desde la finalización de una división hasta el final de la siguiente división, que se divide principalmente en dos etapas: fase intermitótica y fase mitótica (fase M). La fase intercelular se compone principalmente de la fase temprana de la síntesis de ADN (fase G1), la fase tardía de la síntesis de ADN (fase S) y la fase tardía de la síntesis de ADN (fase G2). La secuencia del ciclo celular completo se puede expresar como G1→S→G2→M. En primer lugar, en la fase G1, las células sintetizan principalmente ARN y proteínas para preparar materiales y energía para que las células entren en la fase S. Luego entra en la fase S: ​​las células comienzan a sintetizar ADN y algunas histonas y otras sustancias, y el contenido de ADN celular comienza a aumentar. Finalmente, la fase G2: en este momento, el contenido de ADN de la célula se ha vuelto el doble que el de la fase G1 y ha detenido la replicación del ADN, para ingresar a la fase mitótica para realizar una gran cantidad de síntesis de proteínas y otros materiales; Si la célula está en la fase G0(Las células dejan temporalmente de dividirse, diferenciarse y descansar)/G1, el contenido de ADN de la célula es 1N; Entonces las células en G2 tienen ADN 2N; El contenido de ADN de las células en fase S entre G1 y G2 estaba entre 1N y 2N. En las células apoptóticas, el núcleo se concentrará y se producirá la fragmentación del ADN, lo que provocará la pérdida de parte de los fragmentos de ADN genómico, por lo que el contenido de ADN es inferior a 1N, y se producirá el llamado pico sub-G1, es decir, el pico de la célula apoptótica. , aparece en el mapa de fluorescencia detectado por citometría de flujo. Por lo tanto, el ciclo y el estado celular se pueden juzgar según el contenido de ADN celular.

 

La apoptosis también se puede detectar observando cambios en la dispersión de la luz celular mediante citometría de flujo. Cuando se produce la apoptosis, el citoplasma y la cromatina se concentran y el núcleo se fragmenta, dando lugar a cuerpos apoptóticos. La cromatina se reduce y la densidad celular aumenta en la etapa de preapoptosis. En la última etapa de la apoptosis, las células producen cuerpos apoptóticos y la dispersión de la luz de las células cambia.

 

El kit de análisis del ciclo celular y la apoptosis utilizó el método clásico de tinción de propidio para detectar y analizar el ciclo celular y la apoptosis. El yoduro de propidio puede incrustarse en el ADN de doble cadena y hacer que emita fluorescencia. El ciclo y el estado de una célula se pueden distinguir por la característica de que la intensidad de la fluorescencia es proporcional al contenido de ADN bicatenario y al cambio regular del contenido de ADN en diferentes ciclos celulares. Este kit se puede utilizar para la detección del ciclo celular y la apoptosis de células tisulares, células adherentes o suspendidas (si se utiliza para la detección del ciclo celular y la apoptosis de un tejido, el tejido debe digerirse hasta alcanzar un estado de célula única antes de la detección).

 

 

Transporte con hielo húmedo; Almacenado a -20 grados alejado de la luz, el tampón de teñido se puede almacenar a 4 grados; Tiene una validez de 12 meses.

 

 

ComponenteNúmero	Componente	G1700-50T
G1700-1	Solución de tinción PI (50×)	500 μL
G1700-2	ARNasa A (50×)	500 μL
G1700-3	Tampón de tinción	25ml
Manual de instrucciones		1 pieza

 

 

1. Medio de cultivo celular que contiene suero;

2. Solución de digestión con tripsina (se recomendó G4001);

3. Tampón PBS (se recomendó G4202);

4. 75% de etanol.

 

 

1. Preparación de muestras de células (el número de células se controla a1×105~1 ×106)

1.1. Para células adherentes:Retire el medio de cultivo, agregue la solución de digestión con tripsina para digerir las células y observe que las células se vuelven redondas y sueltas bajo el microscopio. La digestión se terminó añadiendo una cantidad adecuada de medio celular que contenía suero y las células se eliminaron suavemente para formar la suspensión. La suspensión se transfirió a un tubo de centrífuga, se centrifugó a 1000 g durante 3-5 min y se descartó el sobrenadante para retener la precipitación celular. Luego, la precipitación celular se lavó 1-2 veces con tampón PBS preenfriado y el sobrenadante se descartó mediante centrifugación de la misma manera para retener la precipitación celular.

1.2. Para las células suspendidas:transferir las células a un tubo de centrífuga, centrifugar a 1000 g durante 3-5 min, descartar el sobrenadante y conservar el precipitado celular; Luego, la precipitación celular se lavó 1-2 veces con tampón PBS preenfriado y el sobrenadante se descartó mediante centrifugación de la misma manera para retener la precipitación celular.

1.3. Para células de tejido:Corta el tejido en trozos lo más pequeños posible. Según la fuente del tejido, el bloque de tejido se digirió con tripsina, colagenasa y otras enzimas digestivas, y la suspensión de células individuales se obtuvo filtrando a través de una malla 100-300. La suspensión celular filtrada se transfirió a un tubo de centrífuga, se centrifugó a 1000 g durante 3-5 min y el sobrenadante se descartó para retener la precipitación celular. Luego, la precipitación celular se lavó 1-2 veces con tampón PBS preenfriado y el sobrenadante se descartó mediante centrifugación de la misma manera para retener la precipitación celular.

 

2. Fijación de muestras celulares

2.1. Añadir 1 ml de etanol al 75% preenfriado en hielo a la muestra de precipitación celular recogida y soplar suavemente las células para mezclarlas bien;

2.2. Las células se fijaron a 4 grados durante 30 minutos o más (normalmente 2 horas o más pueden garantizar el efecto de tinción, y 12-24 h puede ser mejor para mejorar el efecto de tinción).

2.3. Después de fijarlas durante un tiempo determinado, las células se centrifugaron a 1000 g durante 3-5 min para eliminar la solución fijadora de etanol y retener el precipitado celular;

2.4. Golpee el fondo del tubo de centrífuga para dispersar las células, resuspendió y lavó las células con tampón PBS, centrifugó a 1000 g durante 3-5 min y desechó el sobrenadante para recoger la precipitación celular;

 

3. Preparación y tinciónof Solución de trabajo

3.1. De acuerdo con la siguiente tabla, la solución de teñido se puede preparar sin luz y la cantidad se puede aumentar o disminuir en igual proporción según los requisitos de uso (la solución de teñido preparada se puede almacenar a 4 grados en poco tiempo, utilice dentro del mismo día);

 

	1 muestra	5Muestras	10 muestras
Tampón de tinción	480 μL	2,4 ml	4,8 ml
Tinción PI (50×)	10 μL	50 μL	100 μL
ARNasaA (50×)	10 μL	50 μL	100 μL
Volumen Total	500 μL	2,5 ml	5ml

 

3.2. Golpee el fondo del tubo de centrífuga para dispersar las células precipitadas en el paso 2.4, luego agregue 500 l de la solución de trabajo de tinción preparada y sople suavemente para dispersar las células y mezclar con la solución de trabajo de tinción;

3.3. Después de la incubación a 37 grados durante 30 minutos en la oscuridad, se puede utilizar la citometría de flujo para la detección.

 

4. Detección de flujoay análisis

La fluorescencia roja se detectó mediante citometría de flujo a una longitud de onda de excitación de 488 nm y también se detectó la dispersión de la luz. El análisis del contenido de ADN celular y el análisis de dispersión de luz se realizaron utilizando el software de análisis apropiado.

 

 

1. Todos los tintes fluorescentes tienen el problema de apagar la fluorescencia, así que trate de evitar la luz durante el uso y almacenamiento.

2. Antes del experimento, se sugiere sincronizar el ciclo celular para evitar grandes diferencias de reproducibilidad causadas por diferentes ciclos celulares.

3. La densidad de siembra de las células experimentales no debe ser demasiado alta ni demasiado baja para evitar la inhibición del contacto o la dependencia de la densidad.

4. Preste atención a la protección cuando utilice la solución de tinción PI, evite el contacto directo con el cuerpo humano o la inhalación.

5. Para su seguridad y salud, use bata de laboratorio y guantes desechables cuando opere.

 

¡Solo para uso en investigación!

 

 

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